如何檢測及解決PCR實驗室污染的方法

【導讀】 面對眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質粒污染、PCR擴增產物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦時，比如在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。

你的實驗結果受到污染的影響了嗎？

生物實驗，大多數實驗檢測都是微觀的，基于細胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對外界環境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護樣本的生存環境的同時，污染也是需要注意的頭等大事，要堅決避免環境中的“雜質”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產物氣溶膠污染等對實驗結果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結果讓無數生物學子抓狂和崩潰。

祿米今天就來扒一扒生物實驗室污染之PCR實驗污染你不知道的事

在眾多的生物實驗室，分子生物學檢測方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優勢已經被廣泛應用，不過正是由于它靈敏度*，極微量的污染源都有可能導致檢測結果的假陽性，所以對環境污染的控制也極為嚴格。面對眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質粒污染、PCR擴增產物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦時，比如在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個非常重要而被忽視的污染源。

雖然這些污染對PCR實驗結果的影響已經受到了廣泛重視，多數實驗室對污染控制都采取了各種辦法，比如定期大掃除清理、劃分操作區域、試劑分裝、操作謹慎、重復實驗、多角度驗證結果。但是微量的核酸片段就能被擴增，所以對污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的，關鍵是需要從源頭控制。目前多數生物試驗室，分子實驗每天都在大規模進行，污染源已經無處不在，特異性的，非特異性的，同源的，非同源的，廣泛分布在樣本容器、實驗室臺面，試劑溶液中、儀器表面內管附著等等，你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎？必須是不行的，實驗室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法，整理跟大家共享。

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合理的實驗室分區

實驗室內各工作區的實驗用品，包括移液器等應。如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺（如生物安全柜、超凈工作臺）內，吸加PCR試劑，工作臺內應放置PCR專業用的微量離心機、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。

正確的實驗操作

1. 吸加PCR試劑和模板的操作應嚴格按要求進行，吸樣要慢，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

2. 實驗的過程中應勤換手套，在進出不同區域或進行模板操作后，都應及時更換手套。

3. 裝有PCR試劑的微量離心管在打開之前應先做瞬時離心（約10s），將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機會。開管動作要輕，以防管內液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。

4. 在同時進行多個PCR反應時，應制備主反應混合液，再分裝至PCR反應管，zui后添加樣品核酸模板，以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。

實驗器具和試劑

1. 實驗室自己配置的試劑，如去離子水、緩沖液等，在使用之前均應高壓滅菌或過濾除菌。

2. 分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應小量分裝，以減少重復取樣次數，并置于-20℃保存，適當時，做到專人。另外，PCR試劑、PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或冰箱。

3. 所有吸頭、反應管等應一次性使用，使用之前，都應經過高壓處理。若條件允許，使用帶濾器的槍頭。各工作區內的移液器要有標識，應固定使用用途，不能交叉使用。

實驗設計

實驗設計方面應遵循實驗室內部質量控制的相關規定，實驗中至少應：

1. 設置目標DNA陽性對照反應。對靶序列所作的適當的稀釋工作應于實驗前在實驗室內別的位置進行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實驗室中專門進行PCR的位置。

2. 設置PCR試劑陰性對照和目標DNA陰性對照反應。